### 培养条件

气相：95%空气 + 5%二氧化碳；温度：37°C

### 传代方法

第一次建议1:2传代，2天后更换培养液。建议同时购买尊龙凯时的产品，享受特惠。收到细胞后，处理培养至良好状态，然后将细胞培养液灌满并封好瓶口，确保运输细胞的最佳方法。

收到细胞时，使用75%酒精喷洒整个细胞瓶进行消毒，然后在超净台内进行严格的无菌操作。将细胞瓶放入37°C、5% CO2的培养箱中静置3-4小时，待细胞状态稳定后再进行后续处理。使用显微镜观察细胞生长情况，并对细胞进行不同倍数的拍照保存（建议40x, 100x, 200x各一张）。前三天的照片为重要售后依据，如未提供照片则默认细胞状态良好。

### 细胞培养步骤

a、细胞传代：当细胞汇合度未超过80%时，将培养瓶中的完全培养液收集至离心管中，留5ml完全培养基，放入37°C、5% CO2的孵箱中培养；当细胞密度超过80%时，即可进行传代。贴壁细胞传代步骤如下：

1. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1-2ml至培养瓶中，放入37°C培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化状态，若细胞大部分变圆并脱落，迅速取回操作台，轻轻敲打培养瓶后加入5ml以上的完全培养基以终止消化。
3. 轻轻吹打细胞，使其完全脱落后吸出，并将悬液转移至15ml离心管中，在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加1-2ml完全培养基重悬。
4. 将细胞悬液按1:2的比例分瓶传代（两个T25瓶），补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，最后放入37°C、5% CO2的细胞培养箱中培养。

悬浮细胞传代步骤如下：

1. 采用半换液法处理，竖着摆放培养瓶在培养箱中静置约1小时，轻轻吸掉3ml左右的培养基，然后补充3ml的完全培养基；如果培养基变色较慢，可以直接添加约500μl的FBS。传代时可直接补充5ml培养基，分为两个培养瓶，通常这样传代3次后可进行一次离心，去除死细胞。
2. 采用离心换液法时，可将细胞悬液收集至离心管中，以1000rpm离心5分钟，弃去上清，补加1-2ml培养液后重悬混匀后，按1:2比例分至新T25瓶中，添加6-8ml按照说明书配置的新的完全培养基以保证细胞生长活力，后续传代根据实际情况按1:2至1:5的比例进行。

b、细胞冻存：当细胞生长至覆盖培养瓶的80%时，弃去培养液，用PBS清洗细胞一次。

1. 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml至培养瓶中，置于显微镜下观察，待细胞回缩变圆后加入5ml完全培养液终止消化，再轻轻吹打使细胞脱落，转移至15ml离心管中，1000rpm离心5分钟。
2. 弃去上清，沉淀细胞加入1ml尊龙凯时的无血清冻存液（货号：C7001），混匀后加入冻存管中。
3. 将冻存细胞直接放入-80°C冰箱，若后期需转入液氮罐，需在-80°C冰箱中存放24小时以上后再转入液氮罐中。

c、细胞复苏：从液氮中取出细胞冻存管（佩戴防护面具），快速置于37°C水浴中解冻，直至冻存管内无结晶，然后用75%的酒精擦拭冻存管外壁。

1. 将冻存管中的细胞移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，1000rpm离心5分钟。
2. 弃去上清，沉淀细胞用5ml完全培养基重悬，接种至T25培养瓶，放于37°C、5% CO2细胞培养箱中培养。
3. 第二天，换用新鲜完全培养基继续培养。

### 注意事项

某些细胞可能在运输过程中容易脱落，这是正常现象。如脱离较多，可将培养瓶内所有培养液收集至离心管中，1000rpm离心5分钟，收集上清作过渡培养（后期进行对比培养）。沉淀加入1-2ml胰酶，轻轻吹打，重悬并消化1-2分钟后加入5ml完全培养基终止反应。再进行离心，弃去上清，补加1-2ml完全培养基重悬。最后按1:2比例进行分瓶传代（两个T25），补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，放入37°C、5% CO2细胞培养箱中继续培养。