活细胞染料（如CFSE）通过与胞内蛋白的共价结合，实现分裂时在子代细胞中均匀分配。随着细胞分裂的进行，染料的荧光强度逐代减半。利用流式细胞术可以检测荧光衰减，从而追踪细胞的增殖代数。

在染料标记过程中，T细胞与CFSE（1-5μM）进行避光孵育10分钟，再用冷培养基结束刺激培养，使用抗CD3/CD28抗体或ConA进行激活，培养48-72小时后进行流式分析。通过检测荧光强度，并使用FlowJo软件拟合分裂峰，能够追踪至多8代的细胞分裂。此方法兼容多色流式分析（如CD4/CD8/活化标志物联用），动态反映增殖异质性。需要注意的是，高浓度的染料可能具有细胞毒性，需进行浓度优化。该方法适用于多种场景，包括基因修饰后的T细胞功能评估、免疫抑制剂的动态药效分析以及亚群增殖差异的研究。

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• a. 小鼠T淋巴细胞培养基（含血清） 货号：C400250
• b. 细胞分选缓冲液（EasylsoBuffer） 货号：EISO0500
• c. 1XPBS 货号：B0150001
• d. ActBeads™ Mouse T细胞激活磁珠(大包装) 货号：AM2001
• e. EasyIso™ mouse CD3 T细胞分离试剂盒 货号：SN4101
• f. EasyIso™ mouse CD4 T细胞分离试剂盒 货号：SN4102
• g. EasyIso™ mouse CD8 T细胞分离试剂盒 货号：SN4103
• h. EasyIso™ mouse Naive CD4 T细胞分离试剂盒 货号：SN4104
• i. EasyIso™ mouse CD19 B细胞分离试剂盒 货号：SN4001

增殖细胞在DNA合成期会摄入胸腺嘧啶类似物（BrdU或EdU），可通过抗体检测（BrdU）或点击化学反应（EdU）来定量增殖细胞的比例。

BrdU法：经过刺激培养后，在T细胞中加入BrdU（10μM）孵育4-24小时，随后进行固定破膜，使用乙醇或甲醛固定，进行酸/酶解以暴露DNA，再用抗BrdU抗体结合荧光二抗，最后通过流式或荧光显微镜进行分析。

EdU法（更加推荐）：在培养中直接加入EdU（10μM），通过Cu⁺催化实现EdU与荧光染料的偶联，从而无需抗体的直接检测。该方法适用于固定时间点的增殖率检测（例如药物处理后24小时效果）以及组织切片的原位增殖分析。

增殖细胞的线粒体代谢会增强，使用还原染料（如MTT/XTT）时，会生成有色产物，其吸光度（OD值）与活细胞数成正相关。刺激培养步骤包括将T细胞接种于96孔板（1×10⁵/孔），然后施加激活剂和染料。在培养结束前4小时加入MTT（0.5 mg/mL）并用DMSO溶解，或直接加入CCK-8试剂（10%）并孵育2-4小时。最后通过酶标仪读取OD₄₅₀（CCK-8）或OD₅₇₀（MTT），操作简便，无需特殊设备，且适合高通量药物筛选。

CCK-8具有低毒性，数据稳定性更强。但需注意，它只能间接反映增殖（代谢活性≠增殖），可能会受到细胞凋亡或坏死的影响。适用的场景包括免疫抑制剂的初步筛选、疫苗佐剂效果评估以及大规模的增殖表型鉴定。

需动态追踪亚群差异时，可考虑使用CFSE（如Th17与Treg之间的增殖动力学），而固定时间点的增殖率检测则更适合采用EdU（操作快速且无需变性）。对于高通量化合物筛选，则建议使用CCK-8（适用于96/384孔板）。

💡 联合使用方案：CFSE与EdU双标记，能够同时分析细胞分裂代数与S期细胞比例（需配备多激光流式仪）。掌握这三种方法的原理和优化要点，将能够满足大部分T细胞增殖相关的研究需求，为免疫机制的探索或治疗的开发提供可靠的数据支持。